Édesapja Dobó Domokos, aki 1498-ban kötött házasságot Cékei Zsófiával. Házasságukból hat gyermek született: Ferenc, László, István, Domokos, Anna és Katalin. Dobó István felesége Sulyok Sára volt, akivel 1550. október 17-én kötött házasságot.
1548-tól Zay Ferenccel együtt az egri vár várnagya lett. (1551-től Zay helyett Mekcsey István volt a másik várnagy). Dobó kapitánysága alatt folytatódott a vár megerősítése. Dobó Istvánt és két testvérét 1551-ben I. Ferdinánd király egyik szomszédjuk (Tegenyei Tamás) ellen elkövetett korábbi erőszakoskodásuk miatt fő- és jószágvesztére ítélte, ami az ostrom idején is érvényben volt, hiszen Dobó Istvánnak csak annyit sikerült elérni, hogy az ítéletet egy évre felfüggesztették.
Az 1552. évi török ostrom tette ismertté a nevét, amikor az egyenlőtlen erőviszonyok ellenére meg tudta védeni a várat. A védők létszáma körülbelül 2000 lehetett, míg az ostromló török katonák száma a korábbi 200 és 80 ezer főre való becslés helyett inkább 40 ezer fő lehetett. Az ostrom során Dobó maga is megsebesült. Dobó és a várvédők hőstettét Tinódi Lantos Sebestyén két históriás énekben örökítette meg, Chiabai Mátyás pedig két latin nyelvű dicsőítő költeményt írt róla. Dobó Déva és Szamosújvár várát kapta jutalmul I. Ferdinándtól, aki 1553-ban erdélyi vajdává nevezte ki és bárói rangra emelte. 1556-ban az erdélyi országgyűlés elhatározta, hogy visszahívja Izabella királynét. Ekkor a szultáni parancsra török, moldvai és havasalföldi seregek nyomultak Erdélybe, Dobó több mint tíz hónapig védte Szamosújvárat, de mivel Ferdinándtól nem jött segítség, kénytelen volt feladni a várat. Izabella a megígért szabad elvonulás ellenére Szamosújváron bebörtönöztette, 1557-ben azonban megszökött.
1558-ban, amikor Erdély ismét elszakadt a Habsburgoktól, elveszett birtokai helyett Léva várát kapta meg. Az 1560-as évekre az ország egyik legnagyobb földbirtokosa lett. Dobónak – bár a köztudatban ma elsősorban mint a hős egri várvédő él – voltak nem éppen hízelgő tulajdonságai is. Fukarsága, pénzsóvársága például közismert volt a 16. században is. Bornemisza Péter az Ördögi kísírtetekről című művében Dobót a telhetetlen csalárdok között említi. Ha a helyzet úgy kívánta, a gazdálkodással és kereskedelemmel foglalkozó Dobó testvérek kíméletlenül elbántak szomszédaikkal, konkurenseikkel és mindent megtettek annak érdekében, hogy új birtokokat szerezzenek. És mivel a család Ung és Bereg vármegyei birtokai határosak voltak Lengyelországgal, Dobó gyakran a királyi vámhelyek megkerülésével szállította ki áruit.
A Tegenyei-ügy – köszönhetően nem utolsó sorban a Perényieknek, a Dobó család régi ellenségeinek – Dobó egész életét végigkísérte, 1568-ban Pozsonyban le is tartóztatták emiatt, de megszökött és a lévai várba menekült. 1569-ben Dobót a pozsonyi országgyűlésre csalták és ott rokonával, Balassa Jánossal (Balassi Bálint apjával) együtt elfogták és felségárulás gyanújával börtönbe zárták, élete utolsó éveit fogságban töltötte a pozsonyi várban. Szabadulásakor (1572) egészsége már erősen megromlott. Visszatért szerednyei várába, ahol hamarosan elhunyt. A családi birtokon, Ruszkán (ma Dobóruszka) temették el. Három gyermeke volt, Dobó Damján, Dobó Ferenc és Dobó Krisztina. Ferenc fia állíttatta apja emlékére azt a síremléket, amely 1832 óta az egri várban látható.